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本试剂盒提供了配制Tricine-SDS-PAGE凝胶所需的各种试剂，用户只需自备制胶器具和蒸馏水，即可配制不同浓度的Tricine-SDS-PAGE凝胶。本制品优化了配方，无须配制夹层胶，且只需一种电泳缓冲液。Tricine-SDS-PAGE凝胶主要用于小分子量蛋白或多肽(1～40kDa)的分析检测，其电泳缓冲系统采用Tris-Tricine电泳缓冲系统，可以对于小分子量的蛋白获得良好的电泳分离效果，适合用于例如胰岛素、β淀粉样蛋白等小分子量蛋白或多肽的电泳以及后续的Western检测。

本试剂盒提供的Gel Buffer使用略偏碱性pH的Tris缓冲液制备，具有较低的pH值，尽可能地减少了蛋白质修饰的干扰，适用于变性蛋白电泳。电泳时使用Tris-Tricine缓冲系统的SDS-PAGE电泳液，推荐使用10×Tricine-SDS-PAGE电泳缓冲液(货号：YTB5799)。电泳后可以使用Tris-Glycine缓冲系统的转膜液进行转膜，推荐使用Western转膜液(货号：YT063)。

在传统的Glycine-SDS-PAGE (也被称为Laemmli-SDS-PAGE，基于Tris-Glycine缓冲系统)中，随着电泳的进行，浓缩胶中来自样品和电泳液中SDS的游离的十二烷基硫酸根离子持续累积，并与小分子量蛋白的结合，阻碍了小分子量蛋白的分离，从而导致条带模糊和分辨率降低，干扰小分子量蛋白的固定和染色。在Tricine-SDS-PAGE中，凝胶缓冲液的pH值较低，并在电泳缓冲液中用Tricine替代Glycine，可以有效降低SDS与小分子量蛋白的结合，使小分子量蛋白或多肽能更好地分离，呈现了更清晰的条带和更高的分辨率。同时，Tricine的pKa值为8.15，Glycine的pKa值为9.6，由于pKa的变化，两种方法对高或低分子量蛋白质的分辨率也各不相同。Glycine-SDS-PAGE的凝胶可以分离高分子量蛋白质(20～200kDa)，但即使是使用较高的丙烯酰胺(Acrylamide)浓度的凝胶(4～20%梯度凝胶)，小于20kDa的蛋白质也会因为扩散等原因较难清楚地分离。Tricine-SDS-PAGE只能用于分离低于100kDa的蛋白质，尤其是20kDa或更低分子量的蛋白质或多肽可以通过这种方法很好地分离。此外，Tricine-SDS-PAGE有助于在蛋白质印迹过程中轻松转移疏水性蛋白质，适用于从二维凝胶中分离疏水性蛋白质以进行质谱分析。

Gel Buffer和凝胶聚合催化剂可以室温保存。30% Acr-Bis(29:1)和TEMED Substitute 4℃避光保存。凝胶聚合催化剂用蒸馏水配制成10%溶液后，分装成小管-20℃保存，通常半年内有效。

本试剂盒约可配制30-50块常规大小的Tricine-SDS-PAGE凝胶。具体可以配制的凝胶数量和凝胶的厚薄以及凝胶的大小有关。

• 凝胶聚合催化剂用水配制成10%溶液后，应当分装成小管-20℃保存。同时应尽量减少室温存放时间，以防失效。
  
• TEMED Substitute易挥发，使用后请盖紧瓶盖。另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切，可通过适当调节凝胶聚合催化剂和TEMED Substitute的用量，控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。
  
• TEMED Substitute易燃，有腐蚀性，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或腐蚀其他物品。
  
• 如果需要30% Acr-Bis(29:1，货号：YT623)向百奥莱博单独订购。

• 准备倒胶的模具。可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具(如0.75mm厚度)，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大Tricine-SDS-PAGE凝胶的模具。制胶前必须把制胶模具冲洗干净，需特别注意不能有SDS残留。
  
• 10%凝胶聚合催化剂的配制：例如称取0.1g凝胶聚合催化剂，用蒸馏水溶解，并定容至1mL，即为10%凝胶聚合催化剂。
  
• 常用蛋白电泳胶的模具(胶板宽度为10厘米)所需下层胶和上层胶体积(下层胶按6厘米高度计算，上层胶按1.5厘米高度计算，均含约0.3mL的冗余量)参见下表。
  

  Gel Thickness	Volume of Resolving Gel	Volume of Stacking Gel
  0.75mm	4.0mL	1.0mL
  1.0mm	5.4mL	1.5mL
  1.5mm	8.0mL	2.0mL

  • 下层胶体积已包含适量冗余，请勿全部用于灌制下层胶，以免灌胶时上层胶高度不够。
• 根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度(凝胶浓度越高，更小分子量的蛋白分辨率越好)，再按照下面的表格配制Tricine-SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：
  

  成分	配制不同体积Tricine-SDS-PAGE凝胶所需各成分的体积(mL)
  7%胶	5	10	20	30	40	50
  超纯水	0.98	1.96	3.98	5.99	7.95	9.81
  30% Acr-Bis(29:1)	1.17	2.33	4.67	7.00	9.33	11.67
  Gel Buffer	2.80	5.60	11.20	16.80	22.40	28.00
  10%凝胶聚合催化剂	0.05	0.10	0.15	0.20	0.30	0.50
  TEMED Substitute	0.002	0.004	0.006	0.008	0.012	0.02
  成分	配制不同体积Tricine-SDS-PAGE凝胶所需各成分的体积(mL)
  9%胶	5	10	20	30	40	50
  超纯水	0.65	1.30	2.64	3.99	5.29	6.48
  30% Acr-Bis(29:1)	1.50	3.00	6.00	9.00	12.00	15.00
  Gel Buffer	2.80	5.60	11.20	16.80	22.40	28.00
  10%凝胶聚合催化剂	0.05	0.10	0.15	0.20	0.30	0.50
  TEMED Substitute	0.002	0.004	0.006	0.008	0.012	0.02
  成分	配制不同体积Tricine-SDS-PAGE凝胶所需各成分的体积(mL)
  10%胶	5	10	20	30	40	50
  超纯水	0.48	0.96	1.98	2.99	3.95	4.81
  30% Acr-Bis(29:1)	1.67	3.33	6.67	10.00	13.33	16.67
  Gel Buffer	2.80	5.60	11.20	16.80	22.40	28.00
  10%凝胶聚合催化剂	0.05	0.10	0.15	0.20	0.30	0.50
  TEMED Substitute	0.002	0.004	0.006	0.008	0.012	0.02
  成分	配制不同体积Tricine-SDS-PAGE凝胶所需各成分的体积(mL)
  12%胶	5	10	20	30	40	50
  超纯水	0.45	0.90	1.84	2.79	3.69	4.48
  30% Acr-Bis(29:1)	2.00	4.00	8.00	12.00	16.00	20.00
  Gel Buffer	2.50	5.00	10.00	15.00	20.00	25.00
  10%凝胶聚合催化剂	0.05	0.10	0.15	0.20	0.30	0.50
  TEMED Substitute	0.002	0.004	0.006	0.008	0.012	0.02
  成分	配制不同体积Tricine-SDS-PAGE凝胶所需各成分的体积(mL)
  15%胶	5	10	20	30	40	50
  超纯水	0.15	0.30	0.64	0.99	1.29	1.48
  30% Acr-Bis(29:1)	2.50	5.00	10.00	15.00	20.00	25.00
  Gel Buffer	2.30	4.60	9.20	13.80	18.40	23.00
  10%凝胶聚合催化剂	0.05	0.10	0.15	0.20	0.30	0.50
  TEMED Substitute	0.002	0.004	0.006	0.008	0.012	0.02
  成分	配制不同体积Tricine-SDS-PAGE凝胶所需各成分的体积(mL)
  16%胶	5	10	20	30	40	50
  超纯水	0.13	0.26	0.58	0.89	1.15	1.31
  30% Acr-Bis(29:1)	2.67	5.33	10.67	16.00	21.33	26.67
  Gel Buffer	2.15	4.30	8.60	12.90	17.20	21.50
  10%凝胶聚合催化剂	0.05	0.10	0.15	0.20	0.30	0.50
  TEMED Substitute	0.002	0.004	0.006	0.008	0.012	0.02

• 按照如下表格配制Tricine-SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)：
  

  成分	配制不同体积Tricine-SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(mL)
  4%胶	2	3	4	6	8	10
  超纯水	1.41	2.11	2.82	4.22	5.64	7.04
  30% Acr-Bis(29:1)	0.27	0.40	0.53	0.80	1.07	1.33
  Gel Buffer	0.30	0.46	0.60	0.91	1.21	1.52
  10%凝胶聚合催化剂	0.02	0.03	0.04	0.06	0.08	0.1
  TEMED Substitute	0.002	0.003	0.004	0.006	0.008	0.01

  • 按照上述顺序依次加入各种试剂，加入TEMED Substitute前先混匀，加入TEMED Substitute后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
  • 通常10～30分钟内胶会凝固。具体的凝固时间和温度及光照有关，上表中10%凝胶聚合催化剂和TEMED Substitute的正常推荐用量是室温为25℃时的推荐用量。为达到与25℃时相近的凝固时间，当室温低于25℃时，可以适当增加10%凝胶聚合催化剂和TEMED Substitute的用量，例如20℃时建议使用正常推荐用量的1.5倍，15℃时建议使用正常推荐用量的2倍。
  • 浓缩胶中可加入适量无迁移PAGE浓缩胶染料便于上样。
• 具体的电泳步骤如下。
  
  • 样品准备：将样品和2×Tricine SDS上样缓冲液(货号：YTB3550)按1:1混合，95℃加热5分钟，以充分变性蛋白。
    
  • 将按照本试剂盒使用说明配制好的凝胶固定在电泳槽中，平稳、缓慢地拔出梳子。
    
  • 电泳缓冲液准备。推荐使用10×Tricine-SDS-PAGE电泳缓冲液(货号：YTB5799)。
    
  • 内槽加满电泳缓冲液，外槽加入电泳缓冲液没过电泳槽底部的阳极即可。
    
  • 上样：将10μL吸头的尖端垂直方向轻轻插入到上样孔中即可上样，枪头避免戳破凝胶，更不能使胶板变形导致样品泄漏。
    
    • 最佳上样量须通过实验来确定，样品过量较易导致条带拖尾和信号过强。
  • 将电泳槽盖子盖好，并将电源线插头插入电泳仪电源插孔(红对红，黑对黑)。一般在150V电压，电泳40～50分钟左右即可，或溴酚蓝条带电泳至凝胶近底部或实验预定的位置。如果需获得更加平整和锐利的条带，可以把电压调整为100～150V，此时电泳时间需要适当延长。实际电泳时间与电泳液质量、凝胶数量等因素有关系，需自行适当调整。
    
  • 转膜：推荐使用Western转膜液(货号：YT063)。转膜时，建议将转膜液中的乙醇或甲醇含量提高至20%～30%，以提高小分子蛋白的转膜效率。同时建议使用0.22μm的印迹膜进行转膜。通常湿转的电流为300～400mA，转膜30～60分钟。